Oprócz antybiotyków i ich produktów transformacji  jako  niebezpieczne mikrozanieczyszczenia dostające się do środowiska wraz ze ściekami oczyszczonymi i  obornikiem można  zakwalifikować  także geny antybiotykooporności (antibiotic resistance genes - ARGs) oraz bakterie lekooporne (antibiotic resistant bacteria - ARB) [Munir i in., 2011, LaPara i in., 2011, Li i in., 2010, Bouki i in., 2013, Pruden i in., 2006]. W środowisku kształtowanym antropogenicznie stwierdzono występowanie drobnoustrojów opornych na prawie wszystkie znane leki  [Kuemmerer, 2004]. Stwarza to potencjalne ryzyko dla zdrowia ludzi i zwierząt ponieważ ARGs i ARB naniesione do środowiska mogą ponownie np. wraz z wodą pitną czy roślinami przedostawać się do organizmów ludzi i zwierząt.

Komisja Europejska nałożyła na kraje Unii obowiązek monitorowania zużycia antybiotyków a także monitorowania rozprzestrzeniania się szczepów bakterii opornych w różnych środowiskach. W materiale klinicznym pochodzącym od ludzi monitoring antybiotykooporności przeprowadzany jest głównie za pomocą szczepów MRSA, VRE czy też szczepów posiadających konkretne mechanizmy oporności np. ESBL(+). W weterynarii, na podstawie wytycznych Unii Europejskiej, monitoruje się oporność na leki występującą u bakterii z rodzaju Campylobacter i Salmonella. W dokumencie wydanym przez Komisję  Europejską  w 2009 roku stwierdza się również konieczność oszacowania  rozprzestrzeniania się drobnoustrojów opornych w środowisku naturalnym człowieka. Monitoring antybiotykooporności w środowisku  ma kolosalne znaczenie ze względu możliwość zagrożenia zdrowia ludzi, spożywających rośliny wyhodowane na polach nawożonych zanieczyszczonym obornikiem, korzystających z wód powierzchniowych w celach rekreacyjnych, a także coraz częstszego wykorzystania wód powierzchniowych  jako źródeł wody pitnej.

Do tej pory literatura naukowa nie jest w stanie odpowiedzieć na pytanie czy koncentracje antybiotyków w środowisku mają bezpośredni wpływ na liczebność bakterii natywnych. Tello i in. [2012] wykazali, że koncentracje antybiotyków  w środowisku są wystarczająco wysokie aby wywołać selektywną presję na bakterie o znaczeniu klinicznym i ograniczyć wzrost bakterii wrażliwych na leki. Gao i in. [2012] wykazali pozytywną korelację pomiędzy zawartością sulfonamidów a koncentracją  bakterii opornych na te antybiotyki, z drugiej zaś strony ci sami autorzy stwierdzili brak takiej zależności dla tetracyklin. Podobnie jest z wynikami uzyskiwanymi przez innych autorów - część z nich [Bouki i in., 2013, Zheng i in., 2011] potwierdza istnienie zależności między opornością bakterii a koncentracją antybiotyków w środowisku, a pozostałym nie udało się wykazać między nimi statystycznie istotnych korelacji [Zhu i in., 2013]. Należy jednakże wziąć pod uwagę fakt, że wzorzec oporności obserwowany w środowisku może być związany z ekspozycją bakterii na mieszaninę leków, ich TPs i metali ciężkich, stąd istnieje potrzeba monitorowania ich obecności [Takasu i in., 2011].

Rys. 1. Podział metod stosowanych w mikrobiologii do określania lekooporności w środowisku

Metody hodowlane są najczęściej podparte odpowiednimi wytycznymi (np. EUCAST http://www.eucast.org/ , CLSI http://clsi.org/ ) co ułatwia standaryzację. Bardzo często do wykrywania bakterii lekoopornych jest stosowana metoda filtracji membranowej  (APHA, 2005). W celu uproszczenia analiz mikrobiologicznych, do podłoży na których hoduje się bakterie można dodać antybiotyków, co powoduje, że wyrosną na nich tylko bakterie lekooporne. Po hodowli, izolaty  poddawane testom pozwalającym określić ich wzór  i poziom oporności. Do tego celu służą wystandaryzowane metody krążków dyfuzyjnych i mikro-rozcieńczeń.  Ponadto, można określić występowanie poszczególnych genów oporności u  lekoopornych izolatów  za pomocą standardowej reakcji PCR. Metody hodowlane są jednak pracochłonne i drogie, dlatego też w chwili obecnej w określaniu antybiotykooporności często stosuje się metody biologii molekularnej. Metody te mają tę zaletę, że pozwalają określać lekooporność również u tych bakterii których nie można wyhodować w laboratorium mikrobiologicznym (stanowią one około 97% całej populacji). Stosowaną dość powszechnie metodą jest ilościowa reakcja PCR (qPCR), pozwalająca określić liczbę kopii genów oporności w środowisku.

Głównym problemem związanym z lekoopornością bakterii jest fakt , że geny związane  z brakiem wrażliwości na antybiotyki są zlokalizowane na elementach mobilnych (plazmidy, transpozony, bakteriofagi i integrony), które mogą się przemieszczać między bakteriami tego samego rodzaju ale także między bakteriami niespokrewnionymi filogenetycznie. Integrony cieszą się szczególnym zainteresowaniem badaczy ponieważ: są najprostszymi elementami związanymi z mobilności kaset genowych, wszystkie mają taką sama budowę i bardzo łatwo wbudowują w swoją strukturę geny oporności. Dlatego też badanie liczebności integronów może stanowić bardzo dobry atlternatywny cel pozwalający  szacować  lekooporność bakterii środowiskowych i możliwości jej przekazywania między komórkami bakterii.

Środowiskowe ARB i ARGs mogą w znacznej mierze pochodzić z oczyszczalni ścieków, które odprowadzają ścieki oczyszczone do odbiorników jakim są wody powierzchniowe.

Tabela 1. Oporność na antybiotyki u izolatów pochodzących ze ścieków oczyszczonych (za: Rizzo i in., 2013)

Tabela 2. Przykładowe geny oporności występujące w ściekach oczyszczonych (za: Rizzo i in., 2013)

1. Bouki C., Venieri D., Diamadopoulos E., 2013. Detection and fate of antibiotic resistant bacteria in wastewater treatment plants: a review. Ecotoxicol Environ Saf. 91:1-9.
2. Gao, P., Munir, M., Xagoraraki, I., 2012. Correlation of tetracycline and sulfonamide antibiotics with corresponding resistance genes and resistant bacteria in a conventional municipal wastewater treatment plant. The Science of the total environment 421-422, 173-183.
3. Kummerer, K., 2004. Resistance in the environment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 54, 311-320.
4. LaPara, T.M., Burch, T.R., McNamara, P.J., Tan, D.T., Yan, M., Eichmiller, J.J., 2011. Tertiary-Treated Municipal Wastewater is a Significant Point Source of Antibiotic Resistance Genes into Duluth-Superior Harbor. Environmental Science & Technology 45.
5. Li, D., Yu, T., Zhang, Y., Yang, M., Li, Z., Liu, M., Qi, R., 2010. Antibiotic Resistance Characteristics of Environmental Bacteria from an Oxytetracycline Production Wastewater Treatment Plant and the Receiving River. Applied and Environmental Microbiology 76, 3444-3451.
6. Munir, M., Wong, K., Xagoraraki, I., 2011. Release of antibiotic resistant bacteria and genes in the effluent and biosolids of five wastewater utilities in Michigan. Water Research 45, 681-693.
7. Pruden, A., Pei, R., Storteboom, H., Carlson, K.H., 2006. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: Studies in northern Colorado. Environmental Science & Technology 40, 7445-7450.
8. Rizzo L¹, Manaia C, Merlin C, Schwartz T, Dagot C, Ploy MC, Michael I, Fatta-Kassinos D. 2013. Urban wastewater treatment plants as hotspots for antibiotic resistant bacteria and genes spread into the environment: a review. Sci Total Environ. 2013 Mar 1;447:345-60
9. Takasu, H., Suzuki, S., Reungsang, A., Pham Hung, V., 2011. Fluoroquinolone (FQ) Contamination Does Not Correlate with Occurrence of FQ-Resistant Bacteria in Aquatic Environments of Vietnam and Thailand. Microbes and Environments 26, 135-143.
10. Tello, A., Austin, B., Telfer, T.C., 2012. Selective Pressure of Antibiotic Pollution on Bacteria of Importance to Public Health. Environmental Health Perspectives 120, 1100-1106.
11. Zheng, S., Qiu, X., Chen, B., Yu, X., Liu, Z., Zhong, G., Li, H., Chen, M., Sun, G., Huang, H., Yu, W., Freestone, D., 2011. Antibiotics pollution in Jiulong River estuary: Source, distribution and bacterial resistance. Chemosphere 84, 1677-1685.
12. Zhu YG, Johnson TA, Su JQ, Qiao M, Guo GX, Stedtfeld RD, Hashsham SA, Tiedje JM., 2013. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms. Proc Natl Acad Sci U S A. 110(9):3435-40.