dr Danuta Packa, dr Alicja Kuraczyk, prof.dr hab. Józef Tworkowski

Odmiana rolnicza w najogólniejszym zarysie powstaje według schematu:

materiał wyjściowy – pojedynki – linie (rody) – materiał mateczny – kwalifikacja do RO na podstawie badań COBORU – odmiana.

Wyprowadzaniem nowych odmian zajmuje się dział hodowli twórczej.

Utrzymanie stabilnego poziomu wartości cech wyhodowanej odmiany, w całym okresie jej reprodukcji, należy do zadań hodowli zachowawczej.

Każdy z działów hodowli posługuje się metodami właściwymi dla realizacji postawionych mu zadań.
W hodowli twórczej podstawę stanowią metody o twórczym charakterze, (krzyżowanie, mutageneza, hodowla odmian transgenicznych) pozwalające uzyskać nowe układy genetyczne cech. W tym dziale hodowli zastosowanie mają także metody selekcji. Ich zadaniem jest wybór osobników, ukierunkowany na pożądane przez hodowcę cechy.

W przypadku gatunków samopylnych, takich jak jęczmień, chodzi także o wysoki stopień homozygotyczności wybieranych roślin. Rośliny homozygotyczne pod względem jakiejś cechy w wyniku samozapylenia wydają potomstwo o identycznym składzie genetycznym, co np. warunkuje odmianie jęczmienia browarnego dobre wyrównanie morfologiczne ziarna.

W hodowli zachowawczej zastosowanie mają niemal wyłącznie metody selekcji.

Materiałem wyjściowym nazywa się różne populacje roślinne, z których hodowca rozpoczyna pracę nad nową odmianą, wykorzystując do krzyżowania, czy też poddając działaniu czynników mutagennych różnego typu i różnego pochodzenia odmiany hodowlane. W szczególnych przypadkach do krzyżowań z odmianami uprawnymi mogą być użyte także materiały dzikie. Mniej lub bardziej heterozygotyczne populacje mieszańcowe, uzyskane w wyniku krzyżowania lub populacje surowych mutantów, stanowią w hodowli twórczej materiał do wyboru tzw. pojedynków i inicjują przejście z metod twórczych do metod selekcji. Pojedynkiem nazywa się roślinę wybraną przez hodowcę pod kątem najkorzystniejszego układu cech z punktu widzenia realizowanego kierunku hodowli i zakwalifikowaną przez hodowcę do dalszych rozmnożeń. Centralnym punktem zainteresowania hodowcy jest osiągnięcie określonego, z reguły wysokiego i stabilnego poziomu wartości cech ważnych dla realizacji obranego kierunku hodowli. Stąd trafny wybór pojedynków musi zostać potwierdzony podczas kilkuletniego ich rozmnażania. Potomstwo jednego pojedynka tworzy tzw. ród. Podstawę selekcji (wyboru) rodów na różnych etapach rozmnożeń stanowią: obserwacje wizualne, opisy biometryczne cech morfologicznych, analizy składu chemicznego oparte o reprezentatywne dla danego rodu próby roślin. Zasadniczą jednak podstawą do selekcji rodów są wyniki ścisłych doświadczeń polowych. W końcowym etapie cyklu hodowlanego tworzony jest materiał mateczny. W jego skład wchodzi zwykle kilka najbardziej wartościowych rodów (wyjątkowo jeden). Materiał mateczny, po potwierdzeniu jego walorów w cyklu doświadczeń odmianowych, które prowadzone są przez COBORU (Centralny Ośrodek Badania Odmian Roślin Uprawnych), może zostać zarejestrowany jako nowa odmiana.

Dobór właściwych, skutecznych metod hodowli jest niezwykle ważnym czynnikiem postępu odmianowego.

Hodowla rekombinacyjna (krzyżówkowa)

W hodowli twórczej jęczmienia najszersze zastosowanie ma krzyżowanie międzyodmianowe.

W zależności od liczby i sposobu łączenia partnerów wykorzystane mogą być różne warianty krzyżowania:

1. A x B – proste (krzyżuje się dwie różne odmiany)
2. A x B x A (B) – wsteczne (mieszańca krzyżuje się z jedną z form wyjściowych)
3. A x B x A (B) x A (B) x A (B) - wsteczne wielokrotne (wypierające)
4. A x B x C x D – dopełniające (połączenie cech kilku odmian)
5. (A x B) x (C x D) – zbieżne (połączenie cech kilku odmian).

Najczęściej prowadzone są krzyżowania proste i dopełniające. Pozwalają one na połączenie zmienności dwóch (1) lub większej liczby partnerów (4), a następnie poszukiwanie pożądanych rekombinantów w rozszczepiającym się potomstwie (F₂ - F₆, F₇). We wszystkich krzyżówkach z użyciem większej liczby partnerów ważna jest kolejność ich włączania do krzyżowań. Zgodnie z podstawowymi zasadami dziedziczenia każdy z dwóch partnerów wprowadza do mieszańca połowę własnej informacji genetycznej. Stąd pozycja odmiany w krzyżówce dopełniającej, włączonej do krzyżowania jako
np. trzecia w kolejności, jest uprzywilejowana w stosunku do wprowadzonych wcześniej.

Krzyżówkę zbieżną (5) stosuje się wówczas, gdy w jednym mieszańcu chcemy zapewnić zrównoważony udział genów poszczególnych partnerów. Jeśli zachodzi potrzeba, zwiększenia w mieszańcu F1 udziału jednej z form rodzicielskich, zastosowanie może mieć krzyżówka wsteczna (2), natomiast krzyżowanie wypierające (3) stosowane jest w przypadku potrzeby przeniesienia cechy warunkowanej pojedynczym genem np. odporności na jakiegoś patogena, z formy dzikiej do uprawnej. Zwykle sześcio - siedmiokrotne przekrzyżowanie mieszańca F₁ z ulepszaną odmianą pozwala, zachowując pożądaną cechę odporności, pozbyć się balastu prymitywnych cech formy dzikiej.

Mutageneza

Hodowla mutacyjna polega na sztucznym wywoływaniu zmian jakościowych w obrębie pojedynczego genu (tzw. mutacje genowe) lub zmian strukturalnych w obrębie chromosomu przy użyciu różnych środków mutagennych, następnie ich bezpośrednim, a częściej pośrednim (poprzez krzyżowanie) wykorzystaniu w hodowli nowych odmian. Mutageneza indukowana należy do metod twórczych o wysokim stopniu trudności, bardzo czaso- i pracochłonnych. Stwarza jednak perspektywę dalszego rozszerzania zmienności genetycznej, po wyczerpaniu możliwości wprowadzenia pożądanego układu genów na drodze krzyżowania.

Do wywoływania mutacji wykorzystuje się różnego rodzaju środki fizyczne (radiacyjne) jak promienie: x, g , b , UV, a także mutagennie działające środki chemiczne o działaniu alkilującym np.: iperyt, epoksydy, etyloamina, czy tez różne barwniki zasadowe i nadtlenki.

Skuteczność działania środka mutagennego zależy od wielu czynników: rodzaju stosowanego środka, jego dawki, rodzaju organu i jego wieku oraz tkanki roślinnej na którą działamy mutagenem, czasu ekspozycji, wrażliwości gatunku na określony środek mutagenny, a także naturalnej skłonności gatunku do mutowania, sposobu rozmnażania gatunku.

Z praktycznego punktu widzenia największe znaczenie w hodowli mają mutacje genowe, mniejsze strukturalne. Mutacje zachodzą na różnych poziomach życiowych rośliny. Mogą dotyczyć morfologii, cech budowy wewnętrznej, składu chemicznego czy cech rozwojowych. Najczęściej pojawiają się mutacje drobne (mikromutacje), zazwyczaj trudne do identyfikacji i wykorzystania.

Bardzo rzadko pojawiają się mutacje zupełnie nowe, a szczególnie rzadko przydatne z punktu widzenia użytkowego.

W całym spektrum mutacji, 99% ma charakter recesywny, co w większości przypadków łączy się z osłabieniem potencjału życiowego rośliny lub wręcz z jej śmiercią. Hodowcy przede wszystkim poszukują wartościowych mutantów warunkowanych genem dominującym, lecz szansa ich znalezienia jest niezwykle mała.

Selekcja mutantów prowadzona jest w kolejnych rozszczepiających się genetycznie generacjach, określanych symbolami M₁, M₂, M₃,........, zasadniczo od poziomu M₂. Wartościowe mutanty można jednak często znaleźć nawet w pokoleniach M₄, M₅ i dalszych.

Do podstawowych zasad prowadzenia hodowli mutacyjnej należą:

• dobór możliwie najbardziej licznego materiału roślinnego (należy brać pod uwagę bardzo dużą śmiertelność zwłaszcza w generacji M₁)
  
• materiał wyjściowy powinien posiadać możliwie najwyższe walory ogólne, a wymagać poprawy jedynie określonej cechy, której wprowadzenie innymi, alternatywnymi metodami jest niemożliwe lub nieopłacalne ze względów ekonomicznych
  
• stosowanie środka mutagennego najlepiej dobranego dla osiągnięcia konkretnego celu (wstępnie przetestowanego)
  
• zachowanie stosunkowo najliczniejszych, kolejnych, rozszczepiających się generacji, zwłaszcza M₂ aby zwiększyć szansę znalezienia pożądanego typu mutantów

Jednym z ważniejszych ogólnych problemów metodycznych w hodowli mutacyjnej są trudności wyłonienia pożądanych mutantów z bardzo licznych populacji.

Wykorzystanie w hodowli mutacyjnej technik in vitro i różnego rodzaju testów genetycznych pozwala wielokrotnie zwiększyć szansę na znalezienie wartościowych mutantów i w dużym stopniu zmniejsza pracochłonność rozmnażania i oceny mutowanych populacji.

Jęczmień należy do grupy gatunków o największej częstotliwości mutacji spontanicznych, jest przy tym rośliną samopylną, co w znacznym stopniu ułatwia identyfikację zmian mutacyjnych. Osiągnięcia w zakresie hodowli mutacyjnej jęczmienia są bardzo duże. Już w roku 1987 wśród 477 odmian uzyskanych bezpośrednio lub pośrednio drogą mutagenezy, 72 to odmiany jęczmienia. Jak dotąd w licznych przypadkach uzyskano poprawę takich cech jak: plenność, wczesność dojrzewania, zbitość kłosa, odporność na różne rasy mączniaka, odporność na wyleganie (dzięki zwiększonej sztywności słomy lub jej skróceniu), większą wartość odżywczą (dzięki korzystniejszemu składowi aminokwasowemu), nagoziarnistość (nieoplewione ziarniaki mają znacznie obniżoną zawartość włókna a dzięki temu większą strawność niż oplewione).

Selekcja

W hodowli jęczmienia zastosowanie mają trzy metody selekcji: indywidualna, rodowodowa i sfalöfska (ramszów). Decyzja o ich użyciu wiąże się ze stopniem homozygotyczności materiału wyjściowego jak i charakterem dziedziczenia selekcjonowanej cechy.

Selekcja indywidualna

Jest skuteczną metodą wyboru osobników o pożądanym składzie genetycznym. Wytypowane z populacji wyjściowej pojedynki, poddawane są w pierwszym roku hodowli wstępnej ocenie laboratoryjnej cech związanych z plonem. Na podstawie jej wyników kilkaset do kilku tysięcy pojedynków rozmnaża się indywidualnie na poletkach (1–2m²), z zastosowaniem przemiennie, co kilka poletek, wzorca w postaci odmiany. Dalsze postępowanie zakłada indywidualne rozmnażanie potomstw pierwotnie wybranych pojedynków zwanych odtąd rodami i ich selekcję na podstawie obserwacji i wyników doświadczeń polowych. Począwszy od trzeciego roku hodowli prowadzi się równolegle rozmnożenia i doświadczenia. Pierwsze doświadczenia polowe zakłada się siejąc nasiona punktowo na mikropoletkach (2–6m² ). Ocena rodów na tym etapie obejmuje także plonowanie i jakość ziarna po zbiorze. W czwartym roku rody rozmnaża się w typowym doświadczeniu siewnikowym, a w piątym roku zwykle najlepsze z nich bada się w doświadczeniach międzystacyjnych (przedwstępnych). W szóstym roku hodowli, z kilku najlepszych rodów (w krańcowym przypadku jednego), tworzony jest materiał mateczny.

Metoda rodowodowa

Stosuje się ją także w hodowli twórczej jęczmienia. Metodą rodowodową prowadzi się selekcję heterozygotycznego potomstwa mieszańców uzyskanych w wyniku krzyżowania. Selekcję poprzedza krzyżowanie odpowiednio dobranych odmian, co stwarza szansę znalezienia osobników o pożądanym przez hodowcę układzie genów. Pierwsze możliwości wyboru takich roślin pojawiają się w drugim pokoleniu mieszańców (F₂) i zwiększają się z każdą kolejną generacją. Zadawalającego stopnia homozygotyczności pod względem kilku cech selekcjonowanych jednocześnie można oczekiwać na ogół dopiero w F₅.
Realizowane jest założenie sukcesywnego wyboru pojedynków o pożądanym przez hodowcę zespole cech w każdej kolejnej generacji mieszańców, poczynając już od drugiego pokolenia (F₂), aż do F₄, a nawet F₅ oraz rozmnażanie reprezentatywnej części potomstwa każdego pojedynka na odrębnych poletkach.
Potomstwa pojedynków kolejnych generacji, wywodzące się od jednego wspólnego przodka, wybranego z populacji F₂ stanowią wielopokoleniową rodzinę. Praktycznie do poziomu generacji F₅ hodowca podejmuje decyzje wyłącznie na podstawie wyników wizualnej oceny roślin, prowadzonej w obrębie poszczególnych rodzin. Począwszy od F₅ ewentualnie F₆ ustalone genetycznie rodziny rozmnaża się w siewie produkcyjnym i sprząta nasiona ze wszystkich roślin z rodziny łącznie. Część zebranych nasion przeznacza się do założenia doświadczenia polowego pod kątem oceny plenności i jakości. Doświadczenia prowadzi się przez kolejne 2 - 3 sezony wegetacyjne. Zwykle na poziomie F₈ – F₉, na podstawie wyników doświadczeń, dokonuje się ostatecznego wyboru najlepszych rodzin, które łączy się w materiał mateczny. Selekcja rodowodowa jest metodą bardzo pracochłonną ale dobrze prowadzona daje duże szanse uzyskania trwałych efektów. Czas wyprowadzenia odmiany w zależności od możliwości rozmnażania pierwszych generacji w szklarni trwa od 6 do 10 lat.

Metoda sfalöfska (ramszów)

Podobnie jak metoda rodowodowa znajduje zastosowanie w hodowli krzyżówkowej.

Postępowanie polega na prowadzeniu tzw. ramszów czyli rozmnożeń kolejnych generacji mieszańców od F₁ do F₇ (w miarę możliwości kompletnych), bez ingerencji hodowcy, który jest jedynie obserwatorem samorzutnego dochodzenia populacji do homozygotyczności. Metoda ramszów nie prowadzi bezpośrednio do uzyskania odmiany. Jest postępowaniem wprowadzającym do selekcji indywidualnej, mającym na celu osiągnięcie wysokiego poziomu homozygotyczności populacji.

Nadaje się do selekcjonowania łatwo rozpoznawalnych cech morfologicznych, uwarunkowanych pojedynczymi genami, mającymi szansę pełnego rozszczepienia do 6 – 7 generacji mieszańców. W porównaniu do metody rodowodowej selekcja ramszów nie wymaga dużych nakładów pracy, jednak czas dochodzenia do odmiany łącznie z selekcją indywidualną jest dużo dłuższy i sięga nawet 15 lat. Pokolenie F₇ lub F₈ jest wówczas materiałem wyjściowym do selekcji indywidualnej.

Kultury in vitro w hodowli roślin

Mianem kultur organów, tkanek i komórek roślinnych in vitro określa się hodowlę roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w sterylnych warunkach. Do powszechnie stosowanych kultur in vitro należą: kultury kalusa, kultury zawiesinowe, kultury pojedynczych komórek, kultury protoplastów (komórek pozbawionych ściany komórkowej), kultury pylników i mikrospor, kultury zarodków, kultury fragmentów roślin.

Kultury in vitro wykorzystywane są do:

• Rozmnażania wegetatywnego roślin otrzymanych z komórek, tkanek i organów; zarówno roślin o niskim współczynniku rozmnażania jak i tych, których nie można rozmnażać w warunkach naturalnych.
• Uzyskiwania roślin mieszańcowych (mieszańców wewnątrzgatunkowych, międzygatunkowych, międzyrodzajowych) poprzez kultury in vitro zarodków mieszańcowych.
• Bezpośredniego zapylania i zapładniania in vitro zalążków w celu pominięcia barier o charakterze morfologicznym lub fizjologicznym, utrudniających bądź uniemożliwiających krzyżowanie.
• Uzyskiwania roślin haploidalnych poprzez kultury in vitro pylników i mikrospor.
• Indukowania mutacji w kulturach pojedynczych komórek i regeneracji roślin o korzystnych cechach użytkowych.
• Uzyskiwania protoplastów oraz fuzji protoplastów roślin należących do różnych gatunków czy rodzajów (krzyżowanie somatyczne).
• Przeprowadzania transformacji genetycznej w kulturach pojedynczych komórek czy protoplastów.
• Odwirusowywania roślin poprzez kultury in vitro merystemów wierzchołkowych (ziemniak, rośliny ozdobne).

W przypadku jęczmienia, dwa z powyższych zastosowań, wykorzystywane są na szeroką skalę: kultury mieszańcowych zarodków oraz kultury pylników i mikrospor, które służą do otrzymywania roślin haploidalnych. Kultury in vitro są źródłem nowego typu zmienności tzw. zmienności somaklonalnej, która może być przydatna w programach hodowlanych. Zmienność somaklonalna jest to jakakolwiek zmienność powstała w wyniku prowadzenia kultury in vitro komórek roślinnych, tkanek, organów i fragmentów roślin oraz roślin z nich zregenerowanych.

Podwojone haploidy

Rośliny haploidalne, posiadające w swoich komórkach gametyczną (n) liczbę chromosomów, stanowią ciekawy materiał do prowadzenia badań genetycznych, jak również mogą być wykorzystywane w hodowli nowych odmian. Istnieją dwie zasadnicze drogi otrzymywania roślin haploidalnych. Jedna polega na eliminacji chromosomów w krzyżówkach oddalonych, z poziomu 2n do n; druga polega na stymulacji do rozwoju komórek generatywnych (mikrospor, komórek woreczka zalążkowego) z ominięciem procesu zapłodnienia.

W przypadku zbóż, metoda haploidyzacji poprzez eliminację chromosomów, nazywana jest “metodą bulbosową”. U jęczmienia metoda ta polega na krzyżowaniu Hordeum vulgare z Hordeum bulbosum i regeneracji roślin mieszańcowych w kulturze in vitro. W trakcie rozwoju zarodka chromosomy pochodzące od H. bulbosum ulegają eliminacji. W rezultacie otrzymuje się rośliny zawierające 7 chromosomów H. vulgare i całkowicie pozbawione genomu H. bulbosum.

Drugą drogą otrzymywania haploidów, jest androgeneza – regeneracja roślin z mikrospor, stadium poprzedzającego dojrzałe ziarna pyłku. Jest to bardzo efektywna metoda ze względu na dużą ilość mikrospor w pylniku.

Rośliny haploidalne są wykorzystywane do badań genetycznych, procesu mutagenezy i w hodowli nowych odmian. Ich podstawową zaletą jest haploidalna liczba chromosomów. W wyniku podwojenia liczby chromosomów uzyskuje się podwojone haploidy (DH), które są całkowicie homozygotyczne. Podwojenie chromosomów może nastąpić spontanicznie w haploidalnych komórkach, może też być indukowane na różnych etapach wyprowadzania haploidalnych roślin z kultury in vitro. W tradycyjnej hodowli jęczmienia uzyskanie roślin homozygotycznych z mieszańcowego pokolenia F₁ wymaga prowadzenia samozapylenia roślin heterozygotycznych przez 6-7 pokoleń. Wprowadzenie podwojonych haploidów do programów hodowlanych pozwala na skrócenie procesu otrzymywania nowych odmian, gdyż homozygotyczne linie z heterozygotycznego materiału można uzyskać w ciągu jednego pokolenia.

Obecnie, w Polsce, podwojone haploidy jęczmienia wykorzystywane są głównie w badaniach genetycznych, w znacznie mniejszym stopniu w praktycznej hodowli roślin.

Transformacja genetyczna

Transformowanie roślin polega na wprowadzeniu do komórki roślinnej obcego fragmentu DNA (pochodzącego z innych roślin, mikroorganizmów lub zwierząt) kodującego określoną cechę, ważną z użytkowego punktu widzenia. Transformacja genetyczna jest możliwa u wszystkich roślin uprawnych, jedno- jak i dwuliściennych. Aby dokonać transformacji należy zidentyfikować gen kodujący pożądaną cechę, odpowiednio go przygotować i wprowadzić do komórki. Po wprowadzeniu do komórki obce DNA powinno włączyć się do genomu rośliny, a wprowadzona cecha musi być przekazywana potomnym pokoleniom. Rośliny, które na drodze transformacji genetycznej uzyskały nowe cechy, dotychczas u nich nie występujące, noszą nazwę roślin transgenicznych. Do najczęściej modyfikowanych cech w procesie transformacji różnych roślin uprawnych należą: tolerancja na herbicydy, odporność na owady, odporność na wirusy, odporność na grzyby oraz zmodyfikowana jakość (np. podniesiona zawartość suchej masy, opóźnione dojrzewanie owoców, poprawione cechy przetwórcze, zmodyfikowana struktura i zawartość różnych związków chemicznych).

Transformowanie roślin przeprowadza się różnymi metodami.
Do najczęściej wykorzystywanych należą:

• Transformacja z wykorzystaniem odpowiednio przygotowanych bakterii, należących do Agrobacterium. W metodzie tej wykorzystuje się naturalną zdolność bakterii Agrobacterium tumefaciens i A. rhizogenes do wprowadzania fragmentu swojego DNA plazmidowego do komórki roślinnej. Transformowania dokonuje się przez umieszczenie w kulturze in vitro tkanki roślinnej z odpowiednio przygotowana kulturą bakterii, zawierającą w plazmidzie fragment DNA, który ma być wprowadzony do rośliny. Ta metoda transformacji została wykorzystana dla różnych gatunków roślin dwuliściennych.
• Transformacja bezpośrednia, polegająca na bezpośrednim wprowadzaniu DNA do komórek lub tkanek roślinnych. Bezpośrednie wprowadzanie DNA dokonuje się poprzez tzw. wstrzeliwanie DNA na mikrocząsteczkach wolframu lub złota, przy zastosowaniu “strzelby genowej” (“działka genowego”). Metoda ta może być stosowana dla dowolnego gatunku, ale najczęściej jest wykorzystywana dla roślin jednoliściennych, zwłaszcza zbóż. Możliwe jest transformowanie zarówno tkanek roślinnych (np. tarczka zarodka zbóż) jak i pojedynczych komórek: protoplastów, mikrospor, zawiesin komórkowych mających zdolność wytwarzania zarodków somatycznych. Metodą wstrzeliwania otrzymano m.in. transgeniczne rośliny ryżu, pszenicy, kukurydzy, jęczmienia, owsa. W przypadku jęczmienia polecaną metodą jest wstrzeliwanie obcego DNA do mikrospor. W regenerujących z mikrospor haploidach wystarczy podwoić liczbę chromosomów, aby otrzymać stabilne (homozygotyczne), transgeniczne rośliny.

W Polsce, w wielu laboratoriach, otrzymano transgeniczne rośliny (ziemniak, pszenżyto, ogórek). Natomiast pierwsze doświadczenia polowe z roślinami transgenicznymi (kukurydza, ziemniak, burak, rzepak) wyprodukowanymi przez międzynarodowe firmy biotechnologiczne: Monsanto i AgrEvo zostały założone w Polsce w 1997 roku. Nowe cechy wprowadzone do tych roślin to: gen odporności na herbicyd (glifosat, glufosinat) oraz gen toksyny Bt. Do 2000 roku, wśród odmian zarejestrowanych w Polsce, nie było transgenicznych odmian roślin rolniczych.

Strony WWW projektu Eurequa zostały przygotowane przez Annę Bieńkowską i Roberta d'Aystetten