Pieprz i czarnuszka nadzieją na skuteczniejsze leczenie gruźlicy

Od ponad dwóch dekad pracuje pan z danio pręgowanym. Co sprawia, że właśnie ten organizm stał się tak ważnym narzędziem badawczym? 

Danio pręgowane (Danio rerio) to popularne ryby akwariowe, które dzięki swoim wyjątkowym cechom stały się jednym z najważniejszych organizmów modelowych we współczesnej biologii i medycynie. Nasze laboratorium powstało w  2006 r. i było pierwszym w Polsce wykorzystującym danio pręgowane do celów naukowych. Kiedy zaczynaliśmy, niewiele osób w  kraju wiedziało, jakie możliwości daje ten organizm. Dziś podobnych ośrodków jest już znacznie więcej, a my współpracujemy z wieloma z nich, przekazując nasze doświadczenie. Przez te lata stworzyliśmy całe zaplecze badawcze – od hodowli ryb po specjalistyczne systemy do prowadzenia eksperymentów. Część urządzeń budowaliśmy samodzielnie, zanim pojawiły się gotowe rozwiązania dostępne na rynku. Można powiedzieć, że ten model badawczy rozwijaliśmy od podstaw. Obecnie wykorzystujemy danio pręgowane w wielu projektach naukowych dotyczących m.in. cukrzycy, padaczki, zaburzeń lękowych, regeneracji rdzenia kręgowego, nowotworów czy chorób zakaźnych. Coraz częściej zgłaszają się do nas również naukowcy z innych uczelni, także zagranicznych, którzy chcą wykorzystać ten model we własnych badaniach.

Coraz częściej mówi się o ograniczaniu badań na ssakach laboratoryjnych. Czy danio pręgowane rzeczywiście mogą je zastąpić?

 Nie jest to naszym celem i  w  tej chwili nie jesteśmy w stanie całkowicie zastąpić myszy czy szczurów laboratoryjnych. Danio pręgowane jest przede wszystkim doskonałym etapem przesiewowym. Badania z wykorzystaniem tego modelu są nawet stukrotnie tańsze niż analogiczne eksperymenty prowadzone na myszach. Dzięki temu możemy bardzo szybko przetestować ogromną liczbę potencjalnych substancji. Jeżeli mamy tysiąc związków chemicznych, najpierw analizujemy je na danio pręgowanym, a dokładniej – eksperymenty prowadzimy na embrionach i larwach, a nie dorosłych rybach. Dopiero kilka najbardziej obiecujących trafia do dalszych badań na modelach zwierzęcych. To oznacza nie tylko znaczne ograniczenie kosztów, ale również zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych w eksperymentach. Wpisuje się to w światowy trend rozwoju tzw. New Approach Methodologies, czyli nowoczesnych metod badawczych ograniczających wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych. Embriony i larwy danio pręgowanego, na których prowadzimy eksperymenty, zaliczają się właśnie do tych NAM-sów.

Uniwersytet Warmińsko-Mazurski jest jednym z partnerów projektu OPUS 23 finansowanego przez NCN pt. „Rola produktów naturalnych w przezwyciężaniu lekooporności Mycobacterium tuberculosis”, a pan kieruje realizacją jego części na UWM. Na czym polegają te badania? 

Projekt ten jest odpowiedzią na narastający zarówno w Polsce, jak i na świecie problem lekooporności w leczeniu gruźlicy. Realizujemy go wspólnie z Uniwersytetem Medycznym w  Lublinie oraz Instytutem Gruźlicy i Chorób Płuc w Warszawie. Każdy z ośrodków odpowiada za inny etap badań. Nasi partnerzy analizują przede wszystkim, co dzieje się z bakteriami pod wpływem badanych substancji w warunkach laboratoryjnych, czyli in vitro. My natomiast sprawdzamy, czy obserwowane efekty rzeczywiście występują również w organizmie żywym. To bardzo ważny etap, ponieważ wiele związków wykazuje aktywność w probówce, ale niekoniecznie działa równie skutecznie w żywym organizmie. Nie szukamy substancji, które zastąpią antybiotyki, ale takich, które mogłyby wspomagać standardową terapię i zwiększać skuteczność leczenia gruźlicy.

Jakie substancje są badane? 

Skupiamy się na dwóch naturalnych związkach (adiuwantach) – piperynie, pochodzącej z czarnego pieprzu, oraz tymochinonie obecnym w czarnuszce. Wcześniejsze badania prowadzone przez Uniwersytet Medyczny w Lublinie wykazały, że związki te wpływają na prątki gruźlicy w badaniach in vitro. Naszym zadaniem jest sprawdzenie, czy podobny efekt można zaobserwować również w modelu in vivo, oraz poznanie mechanizmu ich działania. 

Jak wygląda taki eksperyment? 

Nie wykorzystujemy prątka gruźlicy wywołującego chorobę u ludzi, lecz blisko z nim spokrewniony gatunek – Mycobacterium marinum, naturalny patogen ryb. Wywołuje on bardzo podobne zmiany chorobowe i od wielu lat uznawany jest za doskonały model badań nad gruźlicą. Bakterie zostały zmodyfikowane genetycznie tak, aby produkowały czerwone białko fluorescencyjne. Za pomocą mikroinjektora wprowadzamy je do embrionów danio pręgowanego. Ponieważ larwy są przezroczyste, możemy pod mikroskopem fluorescencyjnym na bieżąco obserwować rozwój infekcji i śledzić, jak zmienia się ona po podaniu badanych substancji. To pozwala dosłownie zobaczyć przebieg choroby i ocenić skuteczność terapii w czasie rzeczywistym. Zaletą modelu jest to, że eksperymenty możemy prowadzić na dużą skalę. Jedna samica składa nawet kilkaset jaj, dzięki czemu uzyskujemy bardzo liczne grupy badawcze. Co więcej, są to osobniki będące rodzeństwem, o bardzo podobnym genotypie i w tym samym wieku. Dzięki temu, jak już wspomniałem wcześniej, możemy prowadzić badania in vivo na dużą skalę przy stosunkowo niewielkich kosztach. Przy badaniach na myszach czy szczurach uzyskanie tak licznych i jednorodnych grup jest znacznie trudniejsze oraz dużo droższe. Oprócz obserwacji pod mikroskopem przebiegu zakażenia oceniamy również odpowiedź immunologiczną gospodarza, m.in. poprzez analizę ekspresji genów związanych z reakcją przeciwbakteryjną. Wyniki uzyskane w modelu danio pręgowanego są następnie zestawiane z danymi metabolomicznymi i transkryptomicznymi dotyczącymi prątków, generowanymi przez pozostałych partnerów konsorcjum. Takie zintegrowane podejście pozwala nie tylko ocenić skuteczność badanych połączeń, lecz także lepiej zrozumieć mechanizmy ich działania zarówno na bakterie, jak i na organizm gospodarza.

Na jakim etapie są obecnie badania? Czy pojawiły się już pierwsze wyniki? 

Badania prowadzone na UWM zostały celowo zaplanowane na końcowy etap projektu, ponieważ mają zweryfikować w organizmie żywym wyniki uzyskane wcześniej w warunkach in vitro. Pierwsze rezultaty są bardzo obiecujące i dobrze uzupełniają się z wynikami pozostałych zespołów. W kilku niezależnych eksperymentach zaobserwowaliśmy wyraźną synergię pomiędzy rifampicyną a obydwoma badanymi adiuwantami – piperyną i tymochinonem. Oznacza to, że ich łączne działanie jest silniejsze niż efekt, jakiego można byłoby oczekiwać po prostym zsumowaniu działania każdej z tych substancji osobno. Innymi słowy, adiuwanty wzmacniają skuteczność antybiotyku. Obecnie koncentrujemy się na dokładnym poznaniu mechanizmu tego efektu i połączeniu wszystkich wyników w spójny obraz.

Jaki jest kolejny etap badań? 

Najważniejsze w tej chwili jest dokładne poznanie mechanizmu działania tych substancji. Analizujemy ogromne ilości danych, ponieważ zmiany zachodzą jednocześnie na wielu poziomach metabolizmu bakterii. Zatem nie mamy obecnie jednej prostej odpowiedzi, jak te adiuwanty działają. Kiedy to opracujemy i zrozumiemy, łatwiej nam będzie znaleźć kolejne związki o podobnym mechanizmie lub opracować ich syntetyczne odpowiedniki. To może otworzyć drogę do nowych metod wspomagania leczenia gruźlicy. 

Danio pręgowane wykorzystują państwo w  laboratorium nie tylko w badaniach nad gruźlicą. Jednymi z ciekawszych, o których już pan wspominał, są badania nad nowotworami. 

Tak. W tym obszarze specjalizuje się dr Małgorzata Chmielewska-Krzesińska, która rozwija niezwykle interesującą koncepcję wykorzystania danio pręgowanego do tworzenia tzw. awatarów. Polega to na pobraniu komórek nowotworowych od pacjenta, oznaczeniu ich fluorescencyjnie i wszczepieniu do przezroczystych larw. W ten sposób powstaje model konkretnego nowotworu. Następnie każda larwa poddawana jest działaniu innego leku. Już po kilku dniach możemy ocenić, który preparat najskuteczniej niszczy komórki nowotworowe. To rozwiązanie daje szansę na szybsze i bardziej precyzyjne dobranie terapii. Podobne podejście chcemy rozwijać również w medycynie weterynaryjnej.

Prowadzą państwo również badania nad lękiem i padaczką. Jak wykorzystuje się w nich danio pręgowane? 

W obu przypadkach wykorzystujemy przede wszystkim testy behawioralne prowadzone u larw danio pręgowanego. Za pomocą automatycznych systemów śledzenia ruchu rejestrujemy ich aktywność i reakcje na bodźce. W badaniach nad lękiem analizujemy m.in. zachowanie larw po zmianie warunków oświetlenia, natomiast w modelach padaczki oceniamy charakterystyczny wzrost aktywności ruchowej związany z napadami drgawkowymi. Następnie sprawdzamy, czy badane substancje osłabiają te reakcje. Pozwala to szybko i w sposób ilościowy ocenić ich potencjalne działanie przeciwlękowe lub przeciwdrgawkowe. 

Wspomniał pan także o badaniach nad autyzmem. Jestem ciekawa, jak takie badania się prowadzi. 

Danio pręgowane są rybami stadnymi, dlatego ich zachowanie społeczne łatwo analizować. Za pomocą technologii CRISPR cas9 możemy wyłączyć wybrane geny i stworzyć modele odpowiadające zaburzeniom obserwowanym u ludzi. Następnie porównujemy zachowanie takich ryb z grupą kontrolną, korzystając z systemów automatycznej analizy ruchu i zachowania. 

Patrząc na prowadzone badania, można odnieść wrażenie, że niewielka ryba akwariowa stała się jednym z najważniejszych narzędzi współczesnej biomedycyny.

 To prawda. Danio pręgowane pozwalają nam obserwować procesy chorobowe praktycznie na żywo, testować nowe terapie i poznawać mechanizmy działania leków znacznie szybciej niż jeszcze kilkanaście lat temu. To model wszechstronny, dlatego coraz częściej wykorzystują go uniwersytety oraz instytuty badawcze. Udostępniamy nie tylko nasze modele, ale również wiedzę i doświadczenie zdobywane przez lata. Jestem przekonany, że znaczenie danio pręgowanego w biomedycynie będzie w najbliższych latach stale rosło.

Rozmawiała Sylwia Zalewska

Prof. dr hab. Piotr Podlasz jest pracownikiem Katedry Patofizjologii, Weterynarii Sądowej i Administracji na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej UWM. Od ponad 20 lat prowadzi badania z wykorzystaniem danio pręgowanego jako organizmu modelowego. Zajmuje się m.in. badaniem mechanizmów chorób, poszukiwaniem nowych terapii oraz rozwojem nowoczesnych metod badawczych ograniczających wykorzystanie ssaków laboratoryjnych. W 2025 roku otrzymał tytuł profesora nauk weterynaryjnych. Jest jednym z założycieli Polskiego Towarzystwa „Zebrafish” i zasiada w jego zarządzie.

Tekst ukazał się we wrześniowym numerze „Wiadomości Uniwersyteckich", którego temat przewodnim jest ekologia, czyli jedno z największych wyzwań i zobowiązań współczesności. Badań w tym zakresie prowadzi się na UWM wiele i w wydaniu prezentujemy tylko niektóre z nich. Jest to temat ważny dla przedstawicieli wszystkich wydziałów i dyscyplin naukowych. 

Poza tym informujemy o najważniejszych wydarzeniach z życia społeczności UWM.

Wszystkie wydania naszego uniwersyteckiego pisma dostępne są na >>> stronie internetowej.